《最後的晚餐》是達芬奇非常出名的畫作之一，此畫作取材於《新約聖經》，主體畫呈現的是耶穌跟十二門徒共進最後一次晚餐的畫面。畫面中人物的驚恐、憤怒、懷疑、剖白等神態，以及手勢、眼神和行為，都刻畫得精細入微，惟妙惟肖，是所有以此題材創作的作品中最著名的一幅。
達·芬奇《最後的晚餐》最初創作構思起步於卡斯塔尼奧的作品。繼承了卡氏對宗教題材的情節化的處理方式——在畫中講一個生動、真實的故事。這種宗教題材的世俗化傾向在15世紀有了更進一步的發展。當時，許多畫家喜歡把聖經故事展現於此時此地的現實環境中，並常常在其中畫上自己和朋友的形象，以此為榮。
達·芬奇的《最後的晚餐》不僅標誌着達·芬奇藝術成就的最高峯，也標誌着文藝復興藝術創造的成熟與偉大。這件作品達到了素描表現的正確性和對事物觀察的精確性，使人能真切感受到面對現實世界的一角，在構圖處理上也取得了巨大成就，人物形象的組合構成了美麗的圖案，畫面有着一種輕鬆自然的平衡與和諧。 更為重要的是，他創造性地使聖餐題材的創作向歷史源流的文化本義迴歸，從而賦予了作品以創造的活力和歷史的意義。
